Reaksi gelap adalah tahap kedua fotosintesis, yang menghasilkan glukosa dari energi ATP dan NADPH yang dihasilkan dalam reaksi terang. Ini terjadi di stroma kloroplas. Reaksi gelap terjadi dalam dua mekanisme reaksi: siklus C3 dan siklus C4. Siklus C3 disebut siklus Calvin sedangkan siklus C4 disebut siklus Hatch-Stack. Siklus Calvin terjadi dalam tiga langkah.
Selama langkah pertama, karbon dioksida difiksasi menjadi ribulosa 1,5-bifosfat, membentuk senyawa enam karbon yang tidak stabil, yang kemudian dihidrolisis menjadi tiga senyawa karbon, 3-fosfogliserat. Enzim yang terlibat dalam proses ini adalah rubisco.
Karena ketidaksempurnaan katabolik rubisco, fotorespirasi terjadi di hadapan konsentrasi karbon dioksida yang rendah. Selama langkah kedua, beberapa 3-fosfogliserat direduksi untuk menghasilkan fosfat heksose. 3-fosfogliserat yang tersisa digunakan dalam daur ulang ribulosa 1,5-fosfat.
Selama siklus C4, fiksasi ganda karbon dioksida diamati, meningkatkan efisiensi fotosintesis. Sebelum memasuki siklus Calvin, karbon dioksida difiksasi menjadi fosfoenol piruvat, membentuk empat senyawa karbon, oksaloasetat. Oksaloasetat diubah menjadi malat dan ditransfer ke sel-sel selubung bundar untuk masuk ke dalam siklus Calvin dengan membuang karbon dioksida.
